Respiratory Research2024年11月01日在线发表一项研究成果，中南大学湘雅医院呼吸医学中心和四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室合作研究了干扰素调节因子1（IRF1）在肺纤维化中的作用及其机制，揭示了IRF1在肺纤维化中的关键作用，并提出了IRF1-PON1-GPX4通路作为潜在的治疗靶点。这一发现为肺纤维化的治疗提供了新的思路和理论依据。本论文的通讯作者为中南大学湘雅医院的潘频华教授、陆蓉莉教授和四川大学华西医院的莫春恒教授。

　　研究亮点

　　通过蛋白质组学分析，发现纤维化肺组织中IRF1敲除后多个差异表达基因，尤其是与铁死亡相关的基因，支持了IRF1通过调控铁死亡参与肺纤维化的假说。

　　通过动物模型与体外实验结合揭示了IRF1通过调控PON1和铁死亡参与肺纤维化的机制。

　　IRF1敲除导致纤维化肺组织PON1和GPX4的表达上调，从而抑制铁死亡，减轻肺纤维化，提出IRF1-PON1-GPX4通路在肺纤维化中的重要作用，为开发新的抗纤维化治疗策略提供了理论依据。

　　特发性肺纤维化（IPF）患者血浆中的PON1水平显著低于健康对照组，提示PON1可能作为肺纤维化的潜在生物标志物或治疗靶点。

　　引言：特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）是一种以不可逆转的纤维化为特征的慢性进展性疾病，其起因是肺泡上皮反复受损，导致细胞外基质过度沉积，最终发展为终末肺纤维化。IPF的流行病学调查显示，全球IPF的患病率在0.09/万~1.30/万之间，估计范围从欧洲和北美每年每10万人0.9~9.3例到亚洲和南美每年每10万人3.5~13.0例不等，且呈逐年上升趋势。尽管人们对IPF的兴趣日益浓厚，但纤维化发生与导致肺不可逆破坏的确切分子机制尚不清楚，并且当前也缺乏有效的肺纤维化治疗方法。因此，探索IPF的发病机制，寻找潜在治疗靶点迫在眉睫。

　　干扰素调节因子（Interferon regulatory factors, IRFs）是转录因子家族，包括9个成员（IRF 1-9），它们最初被确定为I型干扰素的转录调节因子，对机体免疫系统和病理生理过程有着重要的影响。IRF1在多种组织和细胞中表达，参与炎症损伤、病毒感染、细胞生长调节、细胞死亡和免疫应答等。众所周知，免疫异常、炎症和细胞死亡是许多肺部疾病的主要发病机制。既往的研究表明，IRF1通过氧化应激、炎症和程序性细胞死亡参与急性肺损伤。最近的研究发现，IRF1参与了心脏、肾脏、肝脏等重要器官的纤维化；IRF1通过下调Klotho参与肾纤维化过程。虽然已有大量的关于IRF1的研究，但其在肺纤维化中的作用及机制尚未完全阐明。

　　在本研究中，我们使用IRF1基因敲除小鼠证明了IRF1在肺纤维化发病机制中发挥的关键作用。这项研究中的蛋白质组分析揭示了IRF1和铁死亡之间通过调节肺纤维化进展中的对氧磷酶1（PON1）的潜在新联系。

　　图1 图片摘要。博来霉素治疗后IRF1上调。它直接与PON1结合，导致PON1表达下调。PON1反过来调节GPX4和MDA的水平，最终导致上皮细胞铁死亡和肺纤维化的发展。

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　　IRF1在博莱霉素诱导的肺纤维化动物模型和IPF患者中上调

　　我们发现在博来霉素（BLM）给药后21天小鼠肺组织中胶原沉积最严重，与PBS组相比，BLM组纤连蛋白(FN)水平升高和I型胶原沉积增加，证实了肺纤维化模型的成功建立。然后，我们检测了IRF1在BLM诱导的肺纤维化模型中的表达。与接受PBS的小鼠相比，接受BLM的小鼠的肺组织IRF1蛋白表达增加。且IRF1的相对定量增高，同时，我们发现IRF1主要在细胞核中表达。与动物实验一致，IPF患者肺组织中IRF1的表达也升高。

　　图2 博来霉素给药后21天建立肺纤维化模型。

　　图3 IRF1 在博来霉素诱导的肺纤维化模型中上调。

　　图4 IPF 患者肺组织中 IRF1 的表达升高

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　　IRF1敲除对博莱霉素诱导的肺纤维化的保护作用

　　我们用BLM处理IRF1敲除(Irf1−/−)小鼠和WT小鼠后发现；与WT小鼠相比，Irf1−/−小鼠BLM处理后体重减轻较少，且Irf1−/−小鼠肺组织胶原沉积水平低于WT小鼠。通过HE染色和Masson染色证实，BLM处理后，相对于Irf1−/−小鼠，WT小鼠肺损伤加重和肺组织胶原沉积增加。在WT小鼠中，BLM处理后21天，肺中FN和细胞外基质（ECM）沉积标志物的表达增加，而这些作用在Irf1−/−小鼠中被抑制。这些结果表明IRF1敲除具有减轻BLM诱导的肺纤维化的作用。

　　图5 IRF1敲除对博莱霉素诱导的肺纤维有保护作用

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　　IRF1可能通过铁死亡通路调控小鼠肺纤维化

　　为了探索IRF1调节的肺纤维化的作用机制，我们对BLM处理后的WT和Irf1−/−小鼠肺组织进行了蛋白质组学分析。与WT小鼠相比，Irf1−/−小鼠有123个基因下调，26个基因上调。韦恩图分析显示，BLM处理后的WT和Irf1−/−小鼠肺组织差异性表达蛋白与BLM处理后的WT小鼠和PBS处理后的WT小鼠肺组织差异性表达蛋白，存在51个差异表达蛋白的重叠。这些重叠基因中前5位的上调基因为脂肪酸结合蛋白1（FABP1）、羰基还原酶2（CBR2）、跨膜蛋白38A（TMEM38a）、淋巴管内皮透明质酸受体-1（LYVE1）和对氧磷酶1（PON1）。前5个下调基因是干扰素诱导的四肽重复序列（IFLIT1）、组织蛋白酶S（CTSS）、LGK-V19-17、组织蛋白酶D（CTSD）和CD68。IFLIT1、CTSS和CTSD蛋白是众所周知的促纤维化因子，qPCR分析证实它们在Irf1−/−小鼠肺组织下调，表明IRF1敲除缓解了BLM诱导的纤维化进程。这些基因的KEGG通路分析表明，最显著改变的细胞过程包括几种程序性细胞死亡通路，包括细胞凋亡和铁死亡。GO分析显示，大多数排名靠前的差异表达基因是肺纤维化模型中涉及的细胞外空间成分和脂质代谢途径的成分。脂质过氧化是铁死亡的标志，直接破坏细胞膜，从而导致铁死亡。GSH和MDA是铁死亡的标志之一，我们发现WT小鼠BLM处理后21天肺组织GSH水平较低，MDA水平升高；敲除IRF1后显示出相反的趋势。同时，我们发现BLM给药后WT小鼠中GPX4的表达下调，而IRF1敲除减轻了这种影响。BLM干预后，WT小鼠的线粒体明显萎缩，线粒体嵴减少或消失，这是铁死亡的典型特征，而敲除IRF1小鼠的线粒体形态得到改善。

　　图6 肺组织的蛋白质组学分析显示Irf1−/−小鼠肺纤维化得到缓解.

　　图7 BLM处理后相对WT小鼠，Irf1−/−小鼠肺组织中铁死亡下调

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　　PON1可能是连接IRF1和铁死亡的分子

　　PON1是一个与脂质代谢密切相关的基因。BLM处理后，与WT小鼠相比，PON1在Irf1−/−小鼠肺组织中上调。同时，在没有BLM刺激的情况下，IRF1的敲除不会改变PON1的表达。然后我们对PON1进行免疫荧光染色，发现PON1主要在细胞膜中表达，并在BLM给药后受到抑制，而其表达可以通过IRF1敲除来挽救。因此，我们推测PON1可能是IRF1的靶标，可能通过脂质氧化调节铁死亡。因此，我们在MLE-12肺泡上皮细胞模型中，通过BLM刺激联合IRF1 siRNA转染实验，发现BLM处理可显著上调核蛋白及全细胞裂解液中IRF1的蛋白水平（p<0.05）。此外，PON1和GPX4的表达通过BLM处理被抑制，但通过IRF1敲低能够部分恢复。阴性对照及IRF1 siRNA处理对GPX4及PON1的表达几乎无影响。BLM干预MLE-12细胞后，观察到MDA水平升高，GSH水平降低。IRF1敲低能够部分逆转这一效应。为深入分析IRF1与PON1的关系，我们通过JASPAR网站获得了IRF1的潜在结合位点，并设计相应的引物。通过ChIP-qPCR验证，IRF1能够与PON1基因的DNA序列结合。与对照组相比，IRF1抗体的信号强度显著增强（2.7倍，倍数富集超过阈值1），表明相对于对照组，IP样品中IRF1结合显著上调。

　　图8 IRF1的敲除影响PON1的表达

　　为了确定PON1的作用，我们在IRF1敲低的细胞中沉默PON1的表达。研究结果表明，PON1的抑制能够抵消由IRF1敲低触发的GPX4上调。此外，IRF1敲低所导致的MDA水平降低被抵消，而PON1沉默导致MDA水平升高，GSH水平再次下降。

　　图9 IRF1通过PON1调控GPX4的表达

　　小结

　　我们的研究证明IRF1在肺纤维化的发病机制中起关键作用。我们的结果揭示了 IRF1 和 PON1 在肺纤维化进展中的潜在新联系。

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　　通讯作者：潘频华 教授

　　医学博士及留美博士后学位

　　博士生导师、博士后导师

　　中南大学湘雅医院呼吸与危重症医学科主任

　　湖南省医学会呼吸病学专业委员会主任委员

　　中华医学会呼吸分会常务委员、呼吸危重症学组副组长及呼吸治疗学组委员

　　擅长呼吸危重症和呼吸衰竭的诊治，以及支气管哮喘和难治性咳嗽的治疗，是湖南最早开展支气管激发试验和舒张试验等技术的专家之一，对呼吸支持技术和ICU感染控制有重要贡献

　　致力于脓毒症和急性呼吸窘迫综合征的临床与基础研究，获得5项国家自然科学基金，发表160余篇论文，主编和参编16部专著，并拥有多项发明专利

　　通讯作者：陆蓉莉 教授

　　临床医学博士

　　中南大学湘雅医院呼吸与危重症医学科的专业呼吸治疗师

　　专注于肺纤维化及机械通气等领域的研究与实践

　　通讯作者：莫春恒 教授

　　医学博士

　　四川大学华西第二医院副研究员

　　研究方向聚焦于血管微环境调控肺再生与纤维化疾病的机制解析与药物开发，相关成果以第一或通讯作者发表在Cell Metabolism, MedComm, Respiratory Research等期刊

　　作为负责人主持国家自然科学基金项目、四川省科技厅项目，国家科技创新2030重大项目骨干，国家自然科学基金重大研究计划项目骨干

　　排版：小智